Тема: Методы работы с биологическими объектами
Общие методы работы с биологическими объектами
Устройство микроскопа
Световой микроскоп – сложный оптический прибор, предназначенный для изучения в сильно увеличенном изображении мельчайших предметов, организмов и структур тканей, не видимых невооруженным глазом. Микроскоп называется световым, так как он обеспечивает возможность изучать объект в проходящем свете, светлом и темном поле зрения, проводить фазовоконтрастную, люминесцентную и другие виды микроскопии.
Устройство микроскопа
Световой микроскоп – сложный оптический прибор, предназначенный для изучения в сильно увеличенном изображении мельчайших предметов, организмов и структур тканей, не видимых невооруженным глазом. Микроскоп называется световым, так как он обеспечивает возможность изучать объект в проходящем свете, светлом и темном поле зрения, проводить фазовоконтрастную, люминесцентную и другие виды микроскопии.
Рис. 1. Общий вид микроскопа
Основные части микроскопа – механическая и оптическая. Механическая часть микроскопа (рис.1) состоит из предметного столика 9, револьвера на салазках 10, конденсора 8. На боковых поверхностях коробки микроскопа расположены рукоятки микромеханизма 9, служащего для точной фокусировки объектива. Слева на оси рукояток закреплен барабан со шкалой, перемещающий тубус. Микромеханизм перемещает тубус вместе с механизмом грубой фокусировки. При вращении рукояток грубой и тонкой фокусировки по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, при вращении против часовой – поднимается. Предметный столик 9 укреплен на специальном кронштейне штатива 3, закрепленном на верхней части коробки микромеханизма. С помощью винтов, находящихся справа и слева на корпусе кронштейна, столик перемещается, что позволяет подвести нужный участок препарата в поле зрения. На поверхности столика расположены отверстия для прижимания препарата. Дугообразный тубусодержатель в нижней своей части имеет рукоятку макровинта 4, служащую для грубой фокусировки микроскопа. В основании штатива находится диск 5 для регулировки точной микронастройки объектива. Верхняя часть тубусодержателя имеет снизу головку для крепления револьвера. Револьвер 10 имеет гнезда с резьбой для крепления объективов. Вращением револьвера осуществляется смена объективов 11. Конденсор 8 крепится в гильзе винтом. Под кронштейном конденсора в коробке микромеханизма укреплена вращающаяся вилка для зеркала. Оптическая часть микроскопа состоит из осветительной и наблюдательной систем. Осветительная система находится под предметным столиком 12. Она состоит из зеркала 7 и конденсора 8 с диафрагмой. Наблюдательная система состоит из объективов 11, призмы и окуляра 1, соединенных в тубусе микроскопа 2. Объективы составляют самую важную часть микроскопа. Они представляют собой систему взаимно центрированных линз, заключенных в металлическую оправу. Каждый объектив характеризуется собственным увеличением, ограничением, разрешающей способностью. Все объективы делятся на сухие и иммерсионные. Сухим называется такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. Объективы сухой системы имеют обычно большое фокусное расстояние и дают малое (х8) или среднее (х40) увеличение.
Иммерсионными, или погруженными, называют такие объективы, между фронтальной линзой которых и препаратом помещается жидкая среда с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. В качестве иммерсионной среды обычно используют кедровое масло. При этом между фронтальной линзой объектива и препаратом устанавливается однородная среда (стекло препарата – масло – стекло объектива) с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, создавая условия для наилучшего освещения препарата (рис.2).
Иммерсионными, или погруженными, называют такие объективы, между фронтальной линзой которых и препаратом помещается жидкая среда с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. В качестве иммерсионной среды обычно используют кедровое масло. При этом между фронтальной линзой объектива и препаратом устанавливается однородная среда (стекло препарата – масло – стекло объектива) с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, создавая условия для наилучшего освещения препарата (рис.2).
Рис. 2. Ход лучей в иммерсионной и воздушной системах микроскопа
Приготовление препаратов микроорганизмов
Препараты живых микроорганизмов
Для определения формы микробов, способности их к спорообразованию, подвижности достаточно бывает исследовать их в живом состоянии. Для этой цели можно пользоваться следующими препаратами.
Раздавленная капля (правила приготовления):
Жидкие культуры разводить в воде не надо: берут каплю зараженного бульона, наносят петлей на предметное стекло и покрывают покровным стеклом. Приготовленный препарат рассматривают под микроскопом с сухой системой с самым большим увеличением объектива и окуляра (40х15 или 60х15).
Прижизненная окраска. При работе с раздавленной каплей для лучшей видимости микробов жидкость можно слегка подкрасить введением под покровное стекло небольшой капли раствора метиленовой сини, нейтрального красного, фуксина водно - спиртового или фуксина основного. При этом бактерии приобретают синюю, красную или розовую окраску, лучше будут видны и легче бывает определить их форму.
Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы остаются длительное время живыми и способными к размножению. Для прижизненной окраски простейших грибов (в том числе и дрожжей), синезеленых водорослей и бактерий применяют красители: нейтральный красный, бриллиантовый крезиловый синий, янусовый зеленый, везувин, фуксин кислый, метиленовая синь.
Приготовление красителей и вспомогательных растворов
Из сухих красителей, существующих в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, сохраняющиеся впрок, но сами по себе непригодные для окраски бактерий. К спирту прибавляется столько сухого красителя, чтобы на дне оставался нерастворимый осадок. Из этих насыщенных растворов готовятся разбавленные водно - спиртовые растворы красителей для окрашивания микробов. Растворы эти не так прочны, как спиртовые, но и они могут служить в течение месяца. Иногда готовятся для окраски и водные (без спирта) 1-2 % растворы сухих красителей. Водные растворы непрочны.
Для усиления действия красителей пользуются: 1) увеличением их концентрации; 2) прибавлением к растворам красителей таких веществ, как анилин, щелочи, карболовая кислота, формалин и др.; 3) увеличением продолжительности окраски и 4) нагреванием красящего раствора.
Продолжительное окрашивание слабыми растворами красителей дает препараты более чистые и потому более отчетливо окрашенные, чем быстрое окрашивание концентрированными красителями.
Метиленовая синь (правила приготовления) - употребляется несколько вариантов красителя.
Насыщенный спиртовой раствор:
Насыщенный водный раствор содержит: 2 г красителя в 100 мл воды (встряхивать изредка в течение 2 дней). Раствор непрочен. Лучше красят растворы с прибавлением щелочи.
Щелочная метиленовая синь (Леффлера):
Эритрозин карболовый. Эритрозином карболовым пользуются для окрашивания препаратов бактерий из почвы.
Дистиллированная вода 100 мл
Карболовая кислота (фенол) 5 г
Эритрозин 1-5 г
После растворения карболовой кислоты и эритрозина жидкости дают отстояться и после этого пользуются ею для окраски препаратов. Раствор этого красителя очень медленно окрашивает бактериальные клетки, но удобен тем, что он плохо окрашивает почвенные частицы.
Фуксин. Хорошо растворим в спирте, плохо в воде: а) Фуксин основной насыщенный спиртовой раствор красителя (10 г сухого красителя в 100 мл 96% спирта); б) водно - спиртовой раствор - (10-20 мл насыщенного спиртового рас- твора в 100 мл воды).
Метиловый фиолетовый – легко растворяется в воде, спирте и хлороформе. Наиболее употребительны следующие растворы: а) 10 мл насыщенного спиртового раствора краски в 100 мл воды, насыщенной анилином; б) насыщенного спиртового раствора 10 мл, дистиллированной воды 20 мл, уксусной кислоты - 2,5 мл.
Генциановый фиолетовый – неочищенный препарат метилового фиолетового, употребляется в тех же растворах. Оба красителя принадлежат к числу наиболее интенсивно красящих веществ: недостаток тот же, что и у фуксина - слишком яркая окраска фона и недостаточная чистота препарата.
Нейтральный красный – 1-1,5% водный раствор. Перед употреблением фильтруется. Хранится в темном флаконе; быстро портится. Обладает слабо красящим свойством, употребляется для окраски микробов в живом состоянии.
Карболовый генциановый фиолетовый (правила приготовления):
Карболовый фуксин Циля (правилаприготовления):
Краситель для жгутиков. Карболовый фуксин Циля или 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10 частей воды.
Протравитель для жгутиков(правила приготовления):
Анилиновая вода (правила приготовления):
Жидкая тушь (правила приготовления):
Препараты фиксированных микроорганизмов
Фиксированным называют препарат, на котором клетки убиты, приклеены к стеклу и окрашены.
Фиксацией и окраской препаратов пользуются в тех случаях, когда необходимо рассмотреть некоторые детали строения клеток (капсулы, споры, вклю- чения, жгутики), вести подсчет микробов или сохранить препарат длительное время.
Окраска по Граму. Главным компонентом клеточных стенок бактерий является гликопептид муреин - гетерополимер, состоящий из цепочек, в которых чередуются последовательно соединенные гликозидными связями остатки ацетилглюкозамина и ацетилмурамовой кислоты. Муреиновый каркас выполняет опорную функцию: на нем отлагаются различные вещества. Количество муреина различно у грамотрицательных и грамположительных бактерий. У грамотрицательных бактерий муреиновая сеть однослойная и составляет 5-12% сухой массы бактериальной клеточной стенки. На муреиновом каркасе располагаются в большом количестве липопротеиды, липополисахариды и фосфолипиды, которые образуют рыхлый слоистый матрикс. У грамположительных бактерий муреиновая сеть многослойная и составляет до 90% сухого веса оболочек бактерий. В составе стенок грамположительных бактерий встречаются тейхоевые кислоты.
Различия в химическом составе и структуре клеточных оболочек являются, по-видимому, одной из причин разной окрашиваемости бактерий по Граму. У грамположительных бактерий комплекс краски с йодом удерживается в стенке после обработки этиловым спиртом, которая уменьшает диаметр пор в гликопептиде. Оболочки грамотрицательных бактерий содержат гораздо меньше гликопептида, молекула которого является более рыхлой, чем у грамположительных бактерий. Можно предположить, что даже после обработки спиртом поры в молекуле гликопептида грамотрицательных бактерий остаются достаточно широкими, что позволяет экстрагировать комплекс генцианвиолет-йод. Метод окраски по Граму служит важным диагностическим признаком при определении некоторых видов микробов.
Правила приготовления:
Окраска спор у бактерий
При наблюдении бактерий в живом состоянии споры их обычно бывают легко различимы благодаря сильному лучепреломлению. Однако еще отчетливее их можно проявить путем специальной окраски. При обычных способах окраски споры прокрашиваются очень слабо: они имеют вид светлых круглых включений, лежащих среди окрашенной бактериальной протоплазмы.
Для окраски спор прибегают к обработке препарата сильно действующими красящими растворами, стараясь достигнуть контрастной окраски спор и протоплазмы клеток. Окрашивание спор сводится к 3 моментам. Сначала сильно перекрашивают препарат (причем окрашиваются как споры, так и палочки, в которых они лежат), затем обесцвечивают так, чтобы отнять краситель у протоплазмы клетки и оставить ее в спорах и потом вновь окрашивают протоплазму в дополнительный цвет.
Способ Ожешки (правила приготовления):
В результате всех операций эти споры оказываются окрашенными в яркий рубиново - красный цвет, вегетативные же клетки — в синий или лиловый.
Способ М. А. Пешкова (правила приготовления):
Окрашивание спор бактерий этими способами хорошо удается лишь в тех случаях, когда культура взята в тот момент, когда споры в клетках уже успели вполне созреть, но еще не выпали из вегетативных клеток, в которых они образовались.
Окраска спор у дрожжей. Для спорообразования у дрожжей необходимы определенные условия. Споры образуют молодые, хорошо питавшиеся дрожжевые клетки в аэробных условиях при большой влажности и при недостатке питания. Для определения способности дрожжей к спорообразованию производят посев 2-3 суточной культуры дрожжей на сусло - агар и выдерживают при 25°С в течение суток. Из этой суточной культуры наносят штрих на поверхность бедной углеводами питательной среды. Можно использовать МПА, морковь, картофель. Посев выдерживают в термостате при 25°С. Препараты приготовляют ежедневно и проверяют под микроскопом в живом состоянии на наличие спорообразования. В сомнительных случаях прибегают к окрашиванию спор.
Фиксированный препарат окрашивают карболовым фуксином (100 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина на 100 мл 5% карболовой воды) в течение 5-10 мин, при нагревании; при этом споры и вся остальная часть клетки окрашивается в красный цвет. Препарат погружают на 1 минуту в подкисленный спирт (спирт+3% соляной кислоты), в котором все части клеток теряют окраску, споры же ее сохраняют. Такой препарат окрашивается дополнительно при нагревании разбавленным раствором метиленовой сини, и при этом вся остальная часть клеток и клетки без спор окрашиваются в светло - голубой цвет, а споры остаются красными.
Окраска клеточных включений
Жир. Включения жира встречаются в клетках многих микробов. Их можно легко обнаружить в клетках Вас. mycoides, в старых культурах дрожжей и дрожжеподобных организмов. Для обнаружения жира лучше всего пользоваться растворимым в жире красителем, например, суданом III (0,1 г судана III + 20 мл 95% спирта). В приготовленную на предметном стекле в капле воды суспензию исследуемых бактерий вносят петлю с раствором судана. Плазма клетки остается бесцветной, а капли жира окрашиваются в оранжево - красный цвет.
Гликоген. Из микробов, почти всегда содержащих гликоген (животный крахмал), надо отметить дрожжи, сенную палочку (Вас. subtilis), Clostridium pasteurianum.
Гликоген встречается в клетке чаще в виде включений, иногда же он находится в протоплазме клетки в растворенном состоянии. Для гликогена характерна окраска йодом в красно - бурый цвет. Для обнаружения гликогена следует пользоваться раствором йода (7 г йода + 20 г йодистого калия в 100 мл воды). Рекомендуется обрабатывать этим раствором предварительно обезжиренные препараты (фиксированные в смеси спирта с эфиром 1:2). Если окрашенные препараты нагреть до 60°С, то окраска гликогена исчезнет. При охлаждении она вновь появляется.
Гранулеза. У некоторых бактерий, например у маслянокислых, встречается в протоплазме клетки в качестве включений гранулеза (крахмалоподобное вещество). Гранулеза окрашивается йодом в темно - синий цвет. Для ее обнаружения препарат окрашивают раствором Люголя. Такая окраска дает возможность проследить за различными стадиями образования гранулезы.
Химический состав клеточной оболочки бактерий мало изучен. В состав клеточной оболочки микроорганизмов могут входить целлюлоза, лигнин, белковые вещества, липиды. Для определения химической природы веществ, вхо- дящих в состав оболочек клеток, служат микрохимические реакции.
Целлюлоза. Окрашивается в фиолетовый цвет от хлор-цинк-йода (20 г хлористого цинка + 6,5 г йодистого калия +1,3 г металлического йода и 10 мл воды).
Лигнин. С флороглюцином и соляной кислотой дает красное окрашивание, с 1% раствором сернокислого анилина, подкисленным серной кислотой, - ярко - желтое.
Окраска жгутиков
При окрашивании жгутиков большое затруднение представляют осадки краски, образующиеся легко на стекле при наличии даже ничтожных количеств белка и пр. Еще большее затруднение составляет непрочность самих жгутиков, которые легко отпадают от клеток в момент приготовления мазка. Вот почему необходимо при этом обращать внимание на чистоту стекла и способ нанесения препарата. Стекло для этой цели рекомендуется промывать в хромовой смеси, а потом в воде перед самым приготовлением мазка полезно сильно нагреть в пламени ту сторону стекла, на которую будет нанесён мазок. Наносить мазок следует на охлажденное стекло.
Материал лучше брать с суточной агаровой культуры, ближе к конденсационной воде. Делают разведение исследуемого материала в пробирках со стерильной водой или же разбавляют в каплях водопроводной воды, нанесенных на покровное стеклышко. Когда достигнуто такое разведение, при котором микробы расположены более или менее изолированно друг от друга, наносят взвесь на предметное стекло. Мазок на стекле распределяют возможно тонким слоем, чтобы ускорить высыхание препарата; при продолжительном высыхании бактерии часто теряют жгутики. Культура должна быть молодой, так как в старой культуре клетки часто теряют жгутики.
Несмотря на большое количество способов, предложенных для окраски жгутиков, особенно надежен способ Леффлера.
Способ Леффлера (правила приготовления):
Для сохранения хорошо удавшихся препаратов их заливают плексигласом. Фиксированный препарат обрабатывают 5% раствором хромовой кислоты, или на высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, наливают 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают 2 минуты (до выделения паров); остудив, сливают кислоту, отмывают водой, дают высохнуть, фиксируют жаром и промывают водой.
К физическим методам стерилизации относятся: стерилизация высокой температурой, ультрафиолетовыми лучами, радиоактивными излучениями, ультразвуком, холодная стерилизация фильтрованием через специальные бактериальные фильтры.
Стерилизация высокой температурой – самый надежный и наиболее распространенный физический метод. Она проводят прокаливанием предметов на пламени горелки, кипячением, сухим жаром, перегретым паром под давлением и текучим паром.
Прокаливание на пламени (600°С, 10-15с) - самый быстрый и надежный способ стерилизации. Этим методом стерилизуют бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметные стекла и другие мелкие предметы.
Кипячение (100°С) - простейший способ стерилизации игл, шприцев, хирургических инструментов. Проводят в специальных стерилизаторах в течение 10-15 минут.
Стерилизация текучим паром применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал (антибиотики, витамины, гормоны) изменяется при температуре свыше 100°С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие белки, углеводы, молоко и др. Для стерилизации текучим паром используют аппарат Коха (рис. 21), который представляет собой металлический цилиндр, на дно которого наливают воду. Над водой имеется сетка, на которой устанавливают стерилизуемый материал.
Сверху аппарат закрывают крышкой с отверстием, через которое пар выходит наружу. Поверхность цилиндра покрыта теплоизолирующим материалом. Стерилизацию проводят в течение 30 мин - 1 ч с момента закипания воды. При этом погибают только вегетативные формы микробов,а споровые сохраняют свою жизнеспособность. Для уничтожения споровых форм прибегают к повторной стерилизации через сутки, повторяя ее три раза. Это так называемая дробная стерилизация.
Тиндализация – разновидность дробной стерилизации. Она проводят с целью уничтожения микроорганизмов и их спор в веществах, легко разрушающихся при температуре выше 60°С (сыворотка крови, витамины и др.)
Прогревание осуществляют в водяных банях или других приборах при температуре 56-58°С в течение 1 часа с 5-6-кратным повторением через каждые 24 часа. В интервалах между прогреваниями материал выдерживают при комнатной температуре. За это время споровые формы микробов прорастают и пре- вращаются в вегетативные, которые погибают при повторных прогревах.
Препараты живых микроорганизмов
Для определения формы микробов, способности их к спорообразованию, подвижности достаточно бывает исследовать их в живом состоянии. Для этой цели можно пользоваться следующими препаратами.
Раздавленная капля (правила приготовления):
- На чистое предметное стекло нанести небольшую каплю водопроводной воды. Дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствует необходимая для микробов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю ими способности к движению.
- В каплю воды внести иглой небольшое количество исследуемых микробов, тщательно размешать.
- Окрасить каплю одним из способов.
- Полученную слегка опалесцирующую суспензию покрыть покровным стек- лом.
Жидкие культуры разводить в воде не надо: берут каплю зараженного бульона, наносят петлей на предметное стекло и покрывают покровным стеклом. Приготовленный препарат рассматривают под микроскопом с сухой системой с самым большим увеличением объектива и окуляра (40х15 или 60х15).
Прижизненная окраска. При работе с раздавленной каплей для лучшей видимости микробов жидкость можно слегка подкрасить введением под покровное стекло небольшой капли раствора метиленовой сини, нейтрального красного, фуксина водно - спиртового или фуксина основного. При этом бактерии приобретают синюю, красную или розовую окраску, лучше будут видны и легче бывает определить их форму.
Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы остаются длительное время живыми и способными к размножению. Для прижизненной окраски простейших грибов (в том числе и дрожжей), синезеленых водорослей и бактерий применяют красители: нейтральный красный, бриллиантовый крезиловый синий, янусовый зеленый, везувин, фуксин кислый, метиленовая синь.
Приготовление красителей и вспомогательных растворов
Из сухих красителей, существующих в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, сохраняющиеся впрок, но сами по себе непригодные для окраски бактерий. К спирту прибавляется столько сухого красителя, чтобы на дне оставался нерастворимый осадок. Из этих насыщенных растворов готовятся разбавленные водно - спиртовые растворы красителей для окрашивания микробов. Растворы эти не так прочны, как спиртовые, но и они могут служить в течение месяца. Иногда готовятся для окраски и водные (без спирта) 1-2 % растворы сухих красителей. Водные растворы непрочны.
Для усиления действия красителей пользуются: 1) увеличением их концентрации; 2) прибавлением к растворам красителей таких веществ, как анилин, щелочи, карболовая кислота, формалин и др.; 3) увеличением продолжительности окраски и 4) нагреванием красящего раствора.
Продолжительное окрашивание слабыми растворами красителей дает препараты более чистые и потому более отчетливо окрашенные, чем быстрое окрашивание концентрированными красителями.
Метиленовая синь (правила приготовления) - употребляется несколько вариантов красителя.
Насыщенный спиртовой раствор:
- К 100 мл 96% спирта прибавить 3г порошка метиленовой сини.
- Оставить на несколько дней (при этом несколько раз встряхивать).
- Раствор отфильтровать.
Насыщенный водный раствор содержит: 2 г красителя в 100 мл воды (встряхивать изредка в течение 2 дней). Раствор непрочен. Лучше красят растворы с прибавлением щелочи.
Щелочная метиленовая синь (Леффлера):
- На 100 мл дистиллированной воды прибавить 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1% раствора КОН. Раствор прочен.
Эритрозин карболовый. Эритрозином карболовым пользуются для окрашивания препаратов бактерий из почвы.
Дистиллированная вода 100 мл
Карболовая кислота (фенол) 5 г
Эритрозин 1-5 г
После растворения карболовой кислоты и эритрозина жидкости дают отстояться и после этого пользуются ею для окраски препаратов. Раствор этого красителя очень медленно окрашивает бактериальные клетки, но удобен тем, что он плохо окрашивает почвенные частицы.
Фуксин. Хорошо растворим в спирте, плохо в воде: а) Фуксин основной насыщенный спиртовой раствор красителя (10 г сухого красителя в 100 мл 96% спирта); б) водно - спиртовой раствор - (10-20 мл насыщенного спиртового рас- твора в 100 мл воды).
Метиловый фиолетовый – легко растворяется в воде, спирте и хлороформе. Наиболее употребительны следующие растворы: а) 10 мл насыщенного спиртового раствора краски в 100 мл воды, насыщенной анилином; б) насыщенного спиртового раствора 10 мл, дистиллированной воды 20 мл, уксусной кислоты - 2,5 мл.
Генциановый фиолетовый – неочищенный препарат метилового фиолетового, употребляется в тех же растворах. Оба красителя принадлежат к числу наиболее интенсивно красящих веществ: недостаток тот же, что и у фуксина - слишком яркая окраска фона и недостаточная чистота препарата.
Нейтральный красный – 1-1,5% водный раствор. Перед употреблением фильтруется. Хранится в темном флаконе; быстро портится. Обладает слабо красящим свойством, употребляется для окраски микробов в живом состоянии.
Карболовый генциановый фиолетовый (правила приготовления):
- Растворить 1 г генцианового фиолетового в 10 мл спирта.
- Полученный раствор прилить к 100 мл 5 % раствора очищенной карболовой кислоты.
- Для устранения осаждения на препарате к раствору добавить немного спирта (по каплям) до исчезновения с поверхности металлически блестящей зеленоватой пленки.
- Растворить 2 г йодистого калияв 5 мл воды.
- Прибавить 1 г йода (для более быстрого растворения эту смесь растереть в фарфоровой ступке).
- Объем довести водой до 300 мл.
Карболовый фуксин Циля (правилаприготовления):
- Растворить 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина в 100 мл 5% карболовой кислоты или 1 г фуксина растиреть в ступке с 10 мл 95% спирта.
- К полученной массе прибавить 5 г кристаллической карболовой кислоты.
- Постепенно прибавлять 100 мл воды.
Краситель для жгутиков. Карболовый фуксин Циля или 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10 частей воды.
Протравитель для жгутиков(правила приготовления):
- Растворить 12 г танина при нагревании в 48 мл воды
- К раствору прибавить 30 мл насыщенного водного раствора железного купороса и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 95% спирте.
- Раствор отфильтровать и сохранять в колбе с притертой пробкой.
Анилиновая вода (правила приготовления):
- Встряхивать 4 мл анилина сильно в течение нескольких минут с 100 мл дистиллированной воды.
- Раствор фильтруется через увлажненный фильтр.
Жидкая тушь (правила приготовления):
- Смешать 1 часть обыкновенной жидкой туши с 9 частями дистиллированной воды (или разбавить водой в отношении 1:1 или 1:2)
- Стерилизовать при 110°С в течение 30 мин в пробирках, закрытых ватными пробками. Можно не производить стерилизации, а прибавлять к туши несколько капель формалина.
Препараты фиксированных микроорганизмов
Фиксированным называют препарат, на котором клетки убиты, приклеены к стеклу и окрашены.
Фиксацией и окраской препаратов пользуются в тех случаях, когда необходимо рассмотреть некоторые детали строения клеток (капсулы, споры, вклю- чения, жгутики), вести подсчет микробов или сохранить препарат длительное время.
Приготовление мазка (правила приготовления):
- На чистое обезжиренное стеклонанести каплю воды.
- Внести иглой немного исследуемого материала, тщательно перемешивают и размазывают тонким слоем по поверхности стекла (2-3 см2). Материал из жидких питательных сред, в том числе из свернувшегося молока, берется петлей и не разводится в капле воды.
- Препараты высушивают при комнатной температуре или осторожно подогревают над пламенем горелки (не допуская вскипания).
- убить микробов, сделать препаратбезопасным;
- обеспечить лучшееприлипание мазка к стеклу, увеличитьсрок его хранения;
- сделать белок более восприимчивым к окраске сложнымиметодами;
- создать возможность изучения препаратов в иммерсионной системе микроскопа.
- этиловым спиртом в течение 5-20 мин;
- смесью равных объемов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова), препарат покрывают смесью и фиксируют до испарения ее, или опускают в смесь на 20 мин;
- метиловым спиртом - 5 мин;
- жидкостью Карнуа (96% этилового спирта 60 мл, хлороформа 30 мл, ледяной уксусной кислоты 10мл) фиксируют в течение 15 мин;
- парами осмиевой кислоты (обладает способностью довольно быстро фиксировать бактериальные клетки, не изменяя их строения).
Окраска по Граму. Главным компонентом клеточных стенок бактерий является гликопептид муреин - гетерополимер, состоящий из цепочек, в которых чередуются последовательно соединенные гликозидными связями остатки ацетилглюкозамина и ацетилмурамовой кислоты. Муреиновый каркас выполняет опорную функцию: на нем отлагаются различные вещества. Количество муреина различно у грамотрицательных и грамположительных бактерий. У грамотрицательных бактерий муреиновая сеть однослойная и составляет 5-12% сухой массы бактериальной клеточной стенки. На муреиновом каркасе располагаются в большом количестве липопротеиды, липополисахариды и фосфолипиды, которые образуют рыхлый слоистый матрикс. У грамположительных бактерий муреиновая сеть многослойная и составляет до 90% сухого веса оболочек бактерий. В составе стенок грамположительных бактерий встречаются тейхоевые кислоты.
Различия в химическом составе и структуре клеточных оболочек являются, по-видимому, одной из причин разной окрашиваемости бактерий по Граму. У грамположительных бактерий комплекс краски с йодом удерживается в стенке после обработки этиловым спиртом, которая уменьшает диаметр пор в гликопептиде. Оболочки грамотрицательных бактерий содержат гораздо меньше гликопептида, молекула которого является более рыхлой, чем у грамположительных бактерий. Можно предположить, что даже после обработки спиртом поры в молекуле гликопептида грамотрицательных бактерий остаются достаточно широкими, что позволяет экстрагировать комплекс генцианвиолет-йод. Метод окраски по Граму служит важным диагностическим признаком при определении некоторых видов микробов.
Правила приготовления:
- На предметном стеклеприготовить мазок, высушитьего.
- Зафиксировать мазок.
- Окрасить в течение 1-2 мин карболовым раствором генцианового фиолетового. Для получения более чистых препаратов рекомендуется покрывать мазок полоской фильтровальной бумаги и уже на нее наносить краситель.
- После окраски препаратпромыть водой.
- Погрузить на 1-2 мин в раствор Люголя. Перед обработкой раствором Люголя препарат можно не обмывать водой, а осторожно удалить избыток краски фильтровальной бумагой.
- Промыть в 96% спирте 0,5-1 мин.
- Препарат дополнительно окрасить фуксином в течение 1-2 мин; грамотрицательные бактерии будут окрашены в красный цвет, а грамположительные - в темно-фиолетовый.
- Все виды семейства Соссасеае за исключением Мicrococcus gonorrheae.
- Все споровые формы: Bac. subtilis, Bac. mycoides и др.
- Дрожжи.
- Молочнокислые стрептококки и палочки. Микробы, не красящиеся по Граму: Bact. coli, Bact.proteus, Chromobact. Prodigiosum.
- Флюоресцирующие бактерии: Ps. fluorescens, Bact.cyanogenes и др.
Окраска спор у бактерий
При наблюдении бактерий в живом состоянии споры их обычно бывают легко различимы благодаря сильному лучепреломлению. Однако еще отчетливее их можно проявить путем специальной окраски. При обычных способах окраски споры прокрашиваются очень слабо: они имеют вид светлых круглых включений, лежащих среди окрашенной бактериальной протоплазмы.
Для окраски спор прибегают к обработке препарата сильно действующими красящими растворами, стараясь достигнуть контрастной окраски спор и протоплазмы клеток. Окрашивание спор сводится к 3 моментам. Сначала сильно перекрашивают препарат (причем окрашиваются как споры, так и палочки, в которых они лежат), затем обесцвечивают так, чтобы отнять краситель у протоплазмы клетки и оставить ее в спорах и потом вновь окрашивают протоплазму в дополнительный цвет.
Способ Ожешки (правила приготовления):
- Фиксированный препарат покрыть полоской фильтровальной бумагой и окрасить карболовым фуксином Циля при подогревании в течение нескольких минут до появления пара, или даже доводя до кипения.
- По мере испарения добавлять краситель, не давая ему подсохнуть во время подогревания.
- Краситель слить, а препарат промытьводой.
- Обесцветить 1-5% раствором серной кислоты (быстрым погружением в стаканчик или ванночку), после чего промыть в ванне с водой.
В результате всех операций эти споры оказываются окрашенными в яркий рубиново - красный цвет, вегетативные же клетки — в синий или лиловый.
Способ М. А. Пешкова (правила приготовления):
- Приготовить и зафиксировать мазок.
- На фиксированный мазок налить метиленовую синь Леффлера и довести ее до кипения, держа препарат над пламенем горелки.
- Кипятить 15-20 сек.
- Смыть водой и докрасить 30 с 0,5% водным раствором нейтрального красного красителя.
- Промыть дистиллированной водой,высушить, смотреть с иммерсией.
Окрашивание спор бактерий этими способами хорошо удается лишь в тех случаях, когда культура взята в тот момент, когда споры в клетках уже успели вполне созреть, но еще не выпали из вегетативных клеток, в которых они образовались.
Окраска спор у дрожжей. Для спорообразования у дрожжей необходимы определенные условия. Споры образуют молодые, хорошо питавшиеся дрожжевые клетки в аэробных условиях при большой влажности и при недостатке питания. Для определения способности дрожжей к спорообразованию производят посев 2-3 суточной культуры дрожжей на сусло - агар и выдерживают при 25°С в течение суток. Из этой суточной культуры наносят штрих на поверхность бедной углеводами питательной среды. Можно использовать МПА, морковь, картофель. Посев выдерживают в термостате при 25°С. Препараты приготовляют ежедневно и проверяют под микроскопом в живом состоянии на наличие спорообразования. В сомнительных случаях прибегают к окрашиванию спор.
Фиксированный препарат окрашивают карболовым фуксином (100 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина на 100 мл 5% карболовой воды) в течение 5-10 мин, при нагревании; при этом споры и вся остальная часть клетки окрашивается в красный цвет. Препарат погружают на 1 минуту в подкисленный спирт (спирт+3% соляной кислоты), в котором все части клеток теряют окраску, споры же ее сохраняют. Такой препарат окрашивается дополнительно при нагревании разбавленным раствором метиленовой сини, и при этом вся остальная часть клеток и клетки без спор окрашиваются в светло - голубой цвет, а споры остаются красными.
Окраска клеточных включений
Жир. Включения жира встречаются в клетках многих микробов. Их можно легко обнаружить в клетках Вас. mycoides, в старых культурах дрожжей и дрожжеподобных организмов. Для обнаружения жира лучше всего пользоваться растворимым в жире красителем, например, суданом III (0,1 г судана III + 20 мл 95% спирта). В приготовленную на предметном стекле в капле воды суспензию исследуемых бактерий вносят петлю с раствором судана. Плазма клетки остается бесцветной, а капли жира окрашиваются в оранжево - красный цвет.
Гликоген. Из микробов, почти всегда содержащих гликоген (животный крахмал), надо отметить дрожжи, сенную палочку (Вас. subtilis), Clostridium pasteurianum.
Гликоген встречается в клетке чаще в виде включений, иногда же он находится в протоплазме клетки в растворенном состоянии. Для гликогена характерна окраска йодом в красно - бурый цвет. Для обнаружения гликогена следует пользоваться раствором йода (7 г йода + 20 г йодистого калия в 100 мл воды). Рекомендуется обрабатывать этим раствором предварительно обезжиренные препараты (фиксированные в смеси спирта с эфиром 1:2). Если окрашенные препараты нагреть до 60°С, то окраска гликогена исчезнет. При охлаждении она вновь появляется.
Гранулеза. У некоторых бактерий, например у маслянокислых, встречается в протоплазме клетки в качестве включений гранулеза (крахмалоподобное вещество). Гранулеза окрашивается йодом в темно - синий цвет. Для ее обнаружения препарат окрашивают раствором Люголя. Такая окраска дает возможность проследить за различными стадиями образования гранулезы.
Химический состав клеточной оболочки бактерий мало изучен. В состав клеточной оболочки микроорганизмов могут входить целлюлоза, лигнин, белковые вещества, липиды. Для определения химической природы веществ, вхо- дящих в состав оболочек клеток, служат микрохимические реакции.
Целлюлоза. Окрашивается в фиолетовый цвет от хлор-цинк-йода (20 г хлористого цинка + 6,5 г йодистого калия +1,3 г металлического йода и 10 мл воды).
Лигнин. С флороглюцином и соляной кислотой дает красное окрашивание, с 1% раствором сернокислого анилина, подкисленным серной кислотой, - ярко - желтое.
Окраска жгутиков
При окрашивании жгутиков большое затруднение представляют осадки краски, образующиеся легко на стекле при наличии даже ничтожных количеств белка и пр. Еще большее затруднение составляет непрочность самих жгутиков, которые легко отпадают от клеток в момент приготовления мазка. Вот почему необходимо при этом обращать внимание на чистоту стекла и способ нанесения препарата. Стекло для этой цели рекомендуется промывать в хромовой смеси, а потом в воде перед самым приготовлением мазка полезно сильно нагреть в пламени ту сторону стекла, на которую будет нанесён мазок. Наносить мазок следует на охлажденное стекло.
Материал лучше брать с суточной агаровой культуры, ближе к конденсационной воде. Делают разведение исследуемого материала в пробирках со стерильной водой или же разбавляют в каплях водопроводной воды, нанесенных на покровное стеклышко. Когда достигнуто такое разведение, при котором микробы расположены более или менее изолированно друг от друга, наносят взвесь на предметное стекло. Мазок на стекле распределяют возможно тонким слоем, чтобы ускорить высыхание препарата; при продолжительном высыхании бактерии часто теряют жгутики. Культура должна быть молодой, так как в старой культуре клетки часто теряют жгутики.
Несмотря на большое количество способов, предложенных для окраски жгутиков, особенно надежен способ Леффлера.
Способ Леффлера (правила приготовления):
- Налить раствор для протравливания на высушенный и осторожно зафиксированный мазок в таком количестве, чтобы весь препарат находился все время под жидкостью.
- Препарат несколько раз нагреть до появления паров. Протравливание ведется в течение 3-5 мин.
- Препарат тщательно промыть водой. Можно протравливать без нагревания в течение 10-15 мин.
- Нанести на поверхность препарата 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10 частей воды.
- Нагреть до появления пара.
- Окрасить карболовым фуксином Циля.
- После окраски препарат промыть водой, высушить и исследовать с иммерсией.
Для сохранения хорошо удавшихся препаратов их заливают плексигласом. Фиксированный препарат обрабатывают 5% раствором хромовой кислоты, или на высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, наливают 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают 2 минуты (до выделения паров); остудив, сливают кислоту, отмывают водой, дают высохнуть, фиксируют жаром и промывают водой.
К физическим методам стерилизации относятся: стерилизация высокой температурой, ультрафиолетовыми лучами, радиоактивными излучениями, ультразвуком, холодная стерилизация фильтрованием через специальные бактериальные фильтры.
Стерилизация высокой температурой – самый надежный и наиболее распространенный физический метод. Она проводят прокаливанием предметов на пламени горелки, кипячением, сухим жаром, перегретым паром под давлением и текучим паром.
Прокаливание на пламени (600°С, 10-15с) - самый быстрый и надежный способ стерилизации. Этим методом стерилизуют бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметные стекла и другие мелкие предметы.
Кипячение (100°С) - простейший способ стерилизации игл, шприцев, хирургических инструментов. Проводят в специальных стерилизаторах в течение 10-15 минут.
Стерилизация текучим паром применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал (антибиотики, витамины, гормоны) изменяется при температуре свыше 100°С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие белки, углеводы, молоко и др. Для стерилизации текучим паром используют аппарат Коха (рис. 21), который представляет собой металлический цилиндр, на дно которого наливают воду. Над водой имеется сетка, на которой устанавливают стерилизуемый материал.
Сверху аппарат закрывают крышкой с отверстием, через которое пар выходит наружу. Поверхность цилиндра покрыта теплоизолирующим материалом. Стерилизацию проводят в течение 30 мин - 1 ч с момента закипания воды. При этом погибают только вегетативные формы микробов,а споровые сохраняют свою жизнеспособность. Для уничтожения споровых форм прибегают к повторной стерилизации через сутки, повторяя ее три раза. Это так называемая дробная стерилизация.
Тиндализация – разновидность дробной стерилизации. Она проводят с целью уничтожения микроорганизмов и их спор в веществах, легко разрушающихся при температуре выше 60°С (сыворотка крови, витамины и др.)
Прогревание осуществляют в водяных банях или других приборах при температуре 56-58°С в течение 1 часа с 5-6-кратным повторением через каждые 24 часа. В интервалах между прогреваниями материал выдерживают при комнатной температуре. За это время споровые формы микробов прорастают и пре- вращаются в вегетативные, которые погибают при повторных прогревах.
Приготовление сред для культивирования микроорганизмов
Всякая микробиологическая работа связана с приготовлением питательных сред для выращивания (культивирования) микроорганизмов. Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста и размножения данного микроба вещества в легко усвояемой форме, быть изотоничной, иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, оптимальный окислительно - восстановительный потенциал, быть стерильной и, по возможности, прозрачной. Питательные среды могут быть классифицированы по консистенции (составу), по физическому состоянию и по назначению.
Среды по происхождению подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. К естественным средам относятся молоко, овощи, фрукты и их отвары, а также отвары из дрожжей, навоза, почвы, мяса, рыбы, круп. Эти среды содержат различные органические вещества, их состав зависит не только от природы сырья, но также и от тех условий, в которых происходил синтез этих веществ.
Среды, приготовленные из строго определенных химических веществ, называются синтетическими. Для лучшего развития микроорганизмов к этим средам иногда прибавляют ничтожные количества витаминов, факторов роста или вытяжки из природных продуктов.
Искусственные среды содержат определенные химические вещества в комбинации их с природными продуктами неопределенного состава. К ним относятся бульоны, картофель с различными сахарами.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими и плотными. Для получения плотных сред из жидких к ним добавляют уплотнители: агар-агар, желатину и кремнекислый гель.
Агар-агар используют особенно часто. Это сложный полисахарид, получаемый из некоторых морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агар-агар образует гели, плавящиеся при 100°С, а затвердевающие при температуре около 40°С. Чаще всего агар-агар добавляют к средам в количестве 2%.
Желатина – это белок, получаемый путем вываривания костей и хрящей животных. Образуемый желатиной гель плавят при температуре 23-26°С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов. Это сильно ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства.
По назначению питательные среды разделяют на обычные, специальные, элективные, селективные и дифференциально-диагностические.
К обычным относят мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА). Они применяются для выращивания основных групп микроорганизмов, многих патогенных и непатогенных гетеротрофных бактерий.
Мясо-пептонный бульон готовят следующим образом:
Специальные среды применяются для выделения и культивирования определенных групп или видов микроорганизмов. Например, среду Омелянского – для выделения возбудителей анаэробного разложения клетчатки, среду Чапека – для культивирования грибов и др.
Среда Омелянского
Среда Чапека
При приготовлении элективных сред ставят задачу создать максимально благоприятные условия для роста микроба одного вида. Например, минеральная среда Эшби для развития Azotobacter, не содержащая солей азота. Состав среды следующий:
Селективные среды позволяют выделить отдельные разновидности микроорганизмов внутри одного вида, которые могут отличаться по скорости роста, по отношению к температуре и др. факторам. Целевое назначение дифференциально-диагностических сред (Гисса, Эндо и др.) состоит в возможности распознавания отдельных видов бактерий по их ферментативным свойствам. Наличие у бактерий ферментов к субстрату, входящему в состав питательной среды, приводит к образованию разных метаболических продуктов.
В бактериологической практике чаще всего используют питательные среды комбинированного состава, включающие мясную воду с добавлением пептона, натрия хлорида, а в некоторых случаях – набора органических и минеральных соединений. Многие питательные среды выпускаются в виде порошка. Для приготовления питательной среды его растворяют в кипящей воде.
Всякая микробиологическая работа связана с приготовлением питательных сред для выращивания (культивирования) микроорганизмов. Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста и размножения данного микроба вещества в легко усвояемой форме, быть изотоничной, иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, оптимальный окислительно - восстановительный потенциал, быть стерильной и, по возможности, прозрачной. Питательные среды могут быть классифицированы по консистенции (составу), по физическому состоянию и по назначению.
Среды по происхождению подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. К естественным средам относятся молоко, овощи, фрукты и их отвары, а также отвары из дрожжей, навоза, почвы, мяса, рыбы, круп. Эти среды содержат различные органические вещества, их состав зависит не только от природы сырья, но также и от тех условий, в которых происходил синтез этих веществ.
Среды, приготовленные из строго определенных химических веществ, называются синтетическими. Для лучшего развития микроорганизмов к этим средам иногда прибавляют ничтожные количества витаминов, факторов роста или вытяжки из природных продуктов.
Искусственные среды содержат определенные химические вещества в комбинации их с природными продуктами неопределенного состава. К ним относятся бульоны, картофель с различными сахарами.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими и плотными. Для получения плотных сред из жидких к ним добавляют уплотнители: агар-агар, желатину и кремнекислый гель.
Агар-агар используют особенно часто. Это сложный полисахарид, получаемый из некоторых морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агар-агар образует гели, плавящиеся при 100°С, а затвердевающие при температуре около 40°С. Чаще всего агар-агар добавляют к средам в количестве 2%.
Желатина – это белок, получаемый путем вываривания костей и хрящей животных. Образуемый желатиной гель плавят при температуре 23-26°С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов. Это сильно ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства.
По назначению питательные среды разделяют на обычные, специальные, элективные, селективные и дифференциально-диагностические.
К обычным относят мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА). Они применяются для выращивания основных групп микроорганизмов, многих патогенных и непатогенных гетеротрофных бактерий.
Мясо-пептонный бульон готовят следующим образом:
- 500 г мяса, освобожденного от костей, жира и сухожилий, разрезать на мелкие кусочки;
- залить 1 л водопроводной воды и оставить при комнатной температуре на 12 часов или в термостате при 30°С на 6 часов. За это время из мяса экстрагируются различные вещества, в том числе и водорастворимые витамины;
- мясо отжать через марлю;
- полученный мясной настой кипятить 30 минут, дать остыть;
- настой отфильтровать через вату;
- долить водой до нужного объема;
- к полученной мясной воде добавить 0,5% NaCl и 1% пептон.
Специальные среды применяются для выделения и культивирования определенных групп или видов микроорганизмов. Например, среду Омелянского – для выделения возбудителей анаэробного разложения клетчатки, среду Чапека – для культивирования грибов и др.
Среда Омелянского
Аммоний фосфорнокислый | 1,0 г |
Калий фосфорнокислый | 1,0 г |
Магний сернокислый | 0,5 г |
Натрий хлористый | Следы |
Кальций углекислый | 20, 0 г |
Фильтровальная бумага | Несколько кусочков |
Дистиллированная вода | 1000,0 мл |
Среда Чапека
Глюкоза (сахар) | 30,0 г |
Натрий азотнокислый | 2,0 г |
Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,0 г |
Магний сернокислый | 0,5 г |
Калий хлористый | 0,5 г |
Железо сернокислое | 0,01 г |
Вода водопроводная | 1000,00 мл |
При приготовлении элективных сред ставят задачу создать максимально благоприятные условия для роста микроба одного вида. Например, минеральная среда Эшби для развития Azotobacter, не содержащая солей азота. Состав среды следующий:
Маннит или глюкоза | 20,0 г |
Калий фосфорный двухосновной | 0,2 г |
Магний сернокислый | 0,2 г |
Натрий хлористый | 0,2 г |
Калий сернокислый | 0,1 г |
Железо сернокислое | Следы |
Мел | 5,0 г |
Вода водопроводная | 1000,00 мл |
Селективные среды позволяют выделить отдельные разновидности микроорганизмов внутри одного вида, которые могут отличаться по скорости роста, по отношению к температуре и др. факторам. Целевое назначение дифференциально-диагностических сред (Гисса, Эндо и др.) состоит в возможности распознавания отдельных видов бактерий по их ферментативным свойствам. Наличие у бактерий ферментов к субстрату, входящему в состав питательной среды, приводит к образованию разных метаболических продуктов.
В бактериологической практике чаще всего используют питательные среды комбинированного состава, включающие мясную воду с добавлением пептона, натрия хлорида, а в некоторых случаях – набора органических и минеральных соединений. Многие питательные среды выпускаются в виде порошка. Для приготовления питательной среды его растворяют в кипящей воде.
Стерилизация
Стерилизация, или обеспложивание, — полное уничтожение микроорганизмов и их спор в питательных средах, посуде, инструментах и других предметах лабораторного обихода. Стерилизация осуществляется различными приемами и является непременным условием работы микробиолога. Наиболее часто применяется химическая и физическая стерилизация.
Химическая стерилизация основана на губительном действии химических веществ на микроорганизмы. Она применяется для обработки вакцин, сывороток и других биопрепаратов, консервируемых различными антисептиками (хлороформом, хинозолом, мертиолятом и др.).
Химические вещества применяют также для уничтожения патогенных микробов в объектах внешней среды: на рабочем месте, в помещениях, в рабочей одежде, на руках. В этих случаях говорят о дезинфекции.
Дезинфекция (от франц. des - отрицательная приставка и лат. infecre - инфекция) – уничтожение в окружающей среде потенциально патогенных микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний (бактерий, вирусов, простейших, грибов и др.). При дезинфекции, или обеззараживании, происходит частичное, селективное освобождение объекта от микроорганизмов. Этим дезинфекция отличается от стерилизации, при которой уничтожают все виды микроорганизмов и их споровые формы.
К физическим методам стерилизации относятся: стерилизация высокой температурой, ультрафиолетовыми лучами, радиоактивными излучениями, ультразвуком, холодная стерилизация фильтрованием через специальные бактериальные фильтры. Стерилизация высокой температурой - самый надежный и наиболее распространенный физический метод. Она проводится прокаливанием предметов на пламени горелки, кипячением, сухим жаром, перегретым паром под давлением и текучим паром. Прокаливание на пламени (600°С, 10-15с) – самый быстрый и надежный способ стерилизации. Этим методом стерилизуют бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметные стекла и другие мелкие предметы. Кипячение (100°С) – простейший способ стерилизации игл, шприцев, хирургических инструментов. Проводят в специальных стерилизаторах в течение 10-15 мин. Стерилизация текучим паром применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал (антибиотики, витамины, гормоны) изменяется при температуре свыше 100°С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие белки, углеводы, молоко и др. Для стерилизации текучим паром используют аппарат Коха (рис.21), который представляет собой металлический цилиндр, на дно которого наливают воду. Над водой имеется сетка, на которой устанавливают стерилизуемый материал. Сверху аппарат закрывают крышкой с отверстием, через которое пар выходит наружу. Поверхность цилиндра покрыта теплоизолирующим материалом. Стерилизацию проводят в течение 30 мин - 1 ч с момента закипания воды. При этом погибают только вегетативные формы микробов, а споровые сохраняют свою жизнеспособность. Для уничтожения споровых форм прибегают к повторной стерилизации через сутки, повторяя ее три раза. Это так называемая дробная стерилизация. Тиндализация – разновидность дробной стерилизации. Она проводится с целью уничтожения микроорганизмов и их спор в веществах, легко разрушающихся при температуре выше 60°С (сыворотка крови, витамины и др.) Прогревание осуществляют в водяных банях или других приборах при температуре 56-58°С в течение 1 ч с 5 – 6-кратным повторением через каждые 24 часа. В интервалах между прогреваниями материал выдерживают при комнатной температуре. За это время споровые формы микробов прорастают и превращаются в вегетативные, которые погибают при повторных прогревах.
Стерилизация, или обеспложивание, — полное уничтожение микроорганизмов и их спор в питательных средах, посуде, инструментах и других предметах лабораторного обихода. Стерилизация осуществляется различными приемами и является непременным условием работы микробиолога. Наиболее часто применяется химическая и физическая стерилизация.
Химическая стерилизация основана на губительном действии химических веществ на микроорганизмы. Она применяется для обработки вакцин, сывороток и других биопрепаратов, консервируемых различными антисептиками (хлороформом, хинозолом, мертиолятом и др.).
Химические вещества применяют также для уничтожения патогенных микробов в объектах внешней среды: на рабочем месте, в помещениях, в рабочей одежде, на руках. В этих случаях говорят о дезинфекции.
Дезинфекция (от франц. des - отрицательная приставка и лат. infecre - инфекция) – уничтожение в окружающей среде потенциально патогенных микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний (бактерий, вирусов, простейших, грибов и др.). При дезинфекции, или обеззараживании, происходит частичное, селективное освобождение объекта от микроорганизмов. Этим дезинфекция отличается от стерилизации, при которой уничтожают все виды микроорганизмов и их споровые формы.
К физическим методам стерилизации относятся: стерилизация высокой температурой, ультрафиолетовыми лучами, радиоактивными излучениями, ультразвуком, холодная стерилизация фильтрованием через специальные бактериальные фильтры. Стерилизация высокой температурой - самый надежный и наиболее распространенный физический метод. Она проводится прокаливанием предметов на пламени горелки, кипячением, сухим жаром, перегретым паром под давлением и текучим паром. Прокаливание на пламени (600°С, 10-15с) – самый быстрый и надежный способ стерилизации. Этим методом стерилизуют бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметные стекла и другие мелкие предметы. Кипячение (100°С) – простейший способ стерилизации игл, шприцев, хирургических инструментов. Проводят в специальных стерилизаторах в течение 10-15 мин. Стерилизация текучим паром применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал (антибиотики, витамины, гормоны) изменяется при температуре свыше 100°С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие белки, углеводы, молоко и др. Для стерилизации текучим паром используют аппарат Коха (рис.21), который представляет собой металлический цилиндр, на дно которого наливают воду. Над водой имеется сетка, на которой устанавливают стерилизуемый материал. Сверху аппарат закрывают крышкой с отверстием, через которое пар выходит наружу. Поверхность цилиндра покрыта теплоизолирующим материалом. Стерилизацию проводят в течение 30 мин - 1 ч с момента закипания воды. При этом погибают только вегетативные формы микробов, а споровые сохраняют свою жизнеспособность. Для уничтожения споровых форм прибегают к повторной стерилизации через сутки, повторяя ее три раза. Это так называемая дробная стерилизация. Тиндализация – разновидность дробной стерилизации. Она проводится с целью уничтожения микроорганизмов и их спор в веществах, легко разрушающихся при температуре выше 60°С (сыворотка крови, витамины и др.) Прогревание осуществляют в водяных банях или других приборах при температуре 56-58°С в течение 1 ч с 5 – 6-кратным повторением через каждые 24 часа. В интервалах между прогреваниями материал выдерживают при комнатной температуре. За это время споровые формы микробов прорастают и превращаются в вегетативные, которые погибают при повторных прогревах.
Рис. 21. Аппарат Коха
Стерилизация паром под давлением – самый эффективный в бактериологической практике способ стерилизации. Даже однократная стерилизация паром под давлением уничтожает не только вегетативные, но и споровые формы бактерий. Стерилизацию паром под давлением проводят в специальных приборах – автоклавах (рис. 22).
Автоклав представляет собой массивный двухстенный котел, окруженный снаружи металлическим кожухом и снабженный откидывающейся крышкой (1), которая плотно привинчивается к котлу специальными болтами (2). Между стенками котла (3) имеется свободное пространство, в которое заливается вода (5) и по которому образующийся при кипении пар через отверстия поступает во внутреннюю камеру (4).
Автоклав снабжен кранами для выпуска пара, манометром, показывающим давление, и специальным предохранительным клапаном, автоматически поддерживающим заданный режим работы. Стерилизацию проводят обычно при 1атм (сверх нормального атмосферного), что соответствует 120,6°С, или при 1,5 атм, что соответствует 126°С. Стерилизуют в автоклаве питательные среды, лабораторную посуду, перевязочный материал, халаты, хирургические инструменты и др.
Автоклав представляет собой массивный двухстенный котел, окруженный снаружи металлическим кожухом и снабженный откидывающейся крышкой (1), которая плотно привинчивается к котлу специальными болтами (2). Между стенками котла (3) имеется свободное пространство, в которое заливается вода (5) и по которому образующийся при кипении пар через отверстия поступает во внутреннюю камеру (4).
Автоклав снабжен кранами для выпуска пара, манометром, показывающим давление, и специальным предохранительным клапаном, автоматически поддерживающим заданный режим работы. Стерилизацию проводят обычно при 1атм (сверх нормального атмосферного), что соответствует 120,6°С, или при 1,5 атм, что соответствует 126°С. Стерилизуют в автоклаве питательные среды, лабораторную посуду, перевязочный материал, халаты, хирургические инструменты и др.
Рис. 22. Схема автоклава
Пастеризация – нагревание материала до 50-65°Св течение 15-30 минут, или до 70-80°С в течение 5-10 минут для уничтожения неспоровых микроорганизмов. Применяется для стерилизации пищевых продуктов (вино, пиво, молоко, соки).
Стерилизация сухим жаром или горячим воздухом осуществляется в специальных печах Пастера (рис. 23) или сухожаровых шкафах. Стерилизуют вату, марлю, чашки Петри, пипетки, колбы и другую стеклянную посуду. Стерилизацию проводят при 160-170°С в течение полутора часов с момента достижения этой температуры.
Пастеризация – прогревание пищевых продуктов при температуре 65-90 °С. Экспозиция зависит от температуры и колеблется от нескольких секунд до 30 минут. В этих условиях гибнут вегетативные формы микробов и остаются споры. Например, моментальная пастеризация проводится при 90°С в течение 3 секунд.
Водяной пар – при превращении в воду выделяет большую скрытую теплоту парообразования, обладает большой проникающей способностью и бактерицидным эффектом. Используется водяной пар для обработки фляг, цистерн, танков и т.п.
Стерилизация сухим жаром или горячим воздухом осуществляется в специальных печах Пастера (рис. 23) или сухожаровых шкафах. Стерилизуют вату, марлю, чашки Петри, пипетки, колбы и другую стеклянную посуду. Стерилизацию проводят при 160-170°С в течение полутора часов с момента достижения этой температуры.
Пастеризация – прогревание пищевых продуктов при температуре 65-90 °С. Экспозиция зависит от температуры и колеблется от нескольких секунд до 30 минут. В этих условиях гибнут вегетативные формы микробов и остаются споры. Например, моментальная пастеризация проводится при 90°С в течение 3 секунд.
Водяной пар – при превращении в воду выделяет большую скрытую теплоту парообразования, обладает большой проникающей способностью и бактерицидным эффектом. Используется водяной пар для обработки фляг, цистерн, танков и т.п.
Рис. 23. Печь Пастора
Стерилизация ультрафиолетовыми лучами применяется для стерилизации воздуха в микробиологических лабораториях, боксах, операционных и т. д. Для этого используют бактерицидные лампы различной мощности (БУВ-15, БУВ - 30 и др.). Чувствительность микробов к ультрафиолетовому излучению разная. Минимальное количество лучистой энергии приводит к гибели E.coli при длине волны 234 нм, Ps. аerogenosa - при 265 нм. Микробы, образующие пигмент (ярко-жёлтый или чёрный) более устойчивы к действию ультрафиолетового излучения. К УФ - излучению наиболее чувствительны клетки в фазе логарифмического роста. Температурные колебания почти не влияют на чувствительность клеток к УФ - излучению, так как в основе лучевого воздействия лежат фотохимические реакции.
Действие рентгеновского излучения известно ещё с 1898 г., когда с их помощью удалось убить культуры кишечной палочки, золотистого стафилококка, холерного вибрионов и других микробов. При облучении микробов дозой 3-5 Гр происходит остановка роста. (1 Гр – грэй – равен дозе облучения, при которой облучённому веществу массой в 1 кг передаётся энергия ионизирующего излучения 1 Дж). Повышенная устойчивость к излучению отмечена у клостридий ботулизма - они погибают только после воздействия на них дозами в 25-40 кГр.
Ультразвук – высокочастотные – 16 кГц и более механические колебания упругой среды, не воспринимаемые ухом человека. (Герц – одно колебание в секунду). Действуя на культуру микроорганизмов, ультразвук создаёт большую разницу в давлениях и повреждает клетку. Часть микробов погибает немедленно, другие подвергаются сильному механическому сотрясению, в результате чего нарушаются физиологические процессы, разжижается и вспенивается цитоплазма, разрывается клеточная стенка и содержимое клетки выходит во внешнюю среду. Ультразвук оказывает губительное действие на сальмонеллы, возбудителя туберкулёза, дрожжевые клетки. Эффективность действия УЗ снижается при содержании в среде протеина. Поэтому использование УЗ для стерилизации молока и других продуктов не всегда даёт желаемые результаты.
Механическую стерилизацию (фильтрование) проводят с помощью мелкопористых фильтров разных типов, задерживающих только клеточные формы микробов и их споры. Фильтры Шамберлена (рис. 24.2) изготовлены из каолина с примесью песка и кварца и имеют вид свечей, полых внутри, с различными размерами пор.
Действие рентгеновского излучения известно ещё с 1898 г., когда с их помощью удалось убить культуры кишечной палочки, золотистого стафилококка, холерного вибрионов и других микробов. При облучении микробов дозой 3-5 Гр происходит остановка роста. (1 Гр – грэй – равен дозе облучения, при которой облучённому веществу массой в 1 кг передаётся энергия ионизирующего излучения 1 Дж). Повышенная устойчивость к излучению отмечена у клостридий ботулизма - они погибают только после воздействия на них дозами в 25-40 кГр.
Ультразвук – высокочастотные – 16 кГц и более механические колебания упругой среды, не воспринимаемые ухом человека. (Герц – одно колебание в секунду). Действуя на культуру микроорганизмов, ультразвук создаёт большую разницу в давлениях и повреждает клетку. Часть микробов погибает немедленно, другие подвергаются сильному механическому сотрясению, в результате чего нарушаются физиологические процессы, разжижается и вспенивается цитоплазма, разрывается клеточная стенка и содержимое клетки выходит во внешнюю среду. Ультразвук оказывает губительное действие на сальмонеллы, возбудителя туберкулёза, дрожжевые клетки. Эффективность действия УЗ снижается при содержании в среде протеина. Поэтому использование УЗ для стерилизации молока и других продуктов не всегда даёт желаемые результаты.
Механическую стерилизацию (фильтрование) проводят с помощью мелкопористых фильтров разных типов, задерживающих только клеточные формы микробов и их споры. Фильтры Шамберлена (рис. 24.2) изготовлены из каолина с примесью песка и кварца и имеют вид свечей, полых внутри, с различными размерами пор.
Рис. 24. Бактериальные фильтры
1 – Зейтца, Шамберлена 2 – Одноразовый полимерный
1 – Зейтца, Шамберлена 2 – Одноразовый полимерный
Фильтр Зейтца (см. рис. 24.1) состоит из асбестовой пластинки, которая монтируется в специальную металлическую воронку, вставленную через резиновую пробку в колбу Бунзена.
Фильтрование проводят под вакуумом. Мембранные фильтры изготовляют из нитроклетчатки. Фильтрованием стерилизуют жидкие материалы, не выдерживающие нагревания (сыворотку крови, антибиотики и др.).
Фильтрование проводят под вакуумом. Мембранные фильтры изготовляют из нитроклетчатки. Фильтрованием стерилизуют жидкие материалы, не выдерживающие нагревания (сыворотку крови, антибиотики и др.).